Выделение ДНК и РНК

Этапы выделения ДНК:



Разрушение клеток: лизис биомассы в буферном растворе с тиоцианатом гуанидина (денатурирует белки). Можно использовать физические методы разрушения клеток - френч-пресс, ультразвук. Ферменты - лизоцим.

Удаление белков: экстракция фенолом или смесью фенола и хлороформа. Наблюдаем разделение фаз:



Преципитация ДНК из раствора: обработка холодным этанолом/изопропанолом. Обычно используют этанол, тк он лучше испаряется. Зато изопропанол лучше осаждает.
Высушивание осадка, суспендирование в буфере (TAE или воде)
Хранение: при -4С. Если хранить при меньшей температуре, ДНК рвется при размораживании.

Различия между хромосомной и плазмидной ДНК, учитываемые при выделении:
хромосомная ДНК очень длинная, легко рвется
плазмидная выдерживает более жесткие воздействие и остается в нативном состоянии
Поэтому для выделения плазмидной ДНК используют щелочной лизис клеток. Далее следует восстановить рН до нейтральных значений. Хромосомная ДНК необратимо денатурирует и оседает вместе с остальными частями клеток. Плазмиды остаются интактными.

Доп. аспекты (как улучшить результат выделения ДНК):
ДНК лучше выделять из активно растущей культуры. В старых культурах происходит лизис, работают нуклеазы; накапливаются мутации.
Избегать сильного перемешивания/пипетирования - можно разорвать ДНК!
Работать следует во льду - избежание действия нуклеаз (могут налететь из воздуха); можно использовать ингибиторы ДНКаз или инактивировать их нагреванием (10 мин 65С)
Кроме описанного метода выделения ДНК, существует метод выделения на колонках.
ДНК связывается с кремниевой мембраной, а затем элюируется специальными растворами ( с высокой ионной силой). Таким образом, очистка ДНК от белков происходит не за счет разделения фаз при добавлении фенола, а за счет связи ДНК с кремниевой подложкой.



Выделение РНК:
Этапы те же, что и для ДНК : разрушение клеток, удаление белков (а еще ДНК!!!), осаждение НК.
добавляют ДНКазы
У ДНК и РНК различная растворимость в органической фазе. При низким рН ДНК переходит в органическую фазу:



Выделение РНК нужно проводить очень стерильно. Должны быть номы, пипетки, посуда для фореза только для работы с РНК . RNAse free!
Ингибирование РНКаз с помощью DEPS или H2O2 , добавляют в воду, обрабатывают ими поверхности и инструменты.
Работать во льду.
Хранить препараты РНК при -70С в этаноле/изопропаноле.
Выделять РНК так же лучше из активно растущих клеток - процессы синтеза белка идут активно.
Количественное определение НК:
на спектрофотометре 260 нм : ОП(260)/ОП(280) =2 , значит чистая НК, типа мало белков, которые поглощают 280 нм (если больше 2 препарат загрязнен белками). Nanodrop.
свечение в УФ с бромистым этидием (интеркалирует в ДНК двуцепочечную)
кПЦР
форез