Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция - молекулярный метод, основанный на репликации НК, для амплификации/ увеличения числа молекул НК в пробе.

Зачем используют ПЦР:
- быстрая амплификация нужного гена
- накопление материала для секвенирования
- создание мутаций (при использовании праймеров с мутацией)
- анализ мутаций, диагностика инфекций, идентификация м/о
- обнаружение незначительных количеств ДНК (в криминалистике)
- амплификация неизвестных фрагментов гена с праймером к известной части гена (дальнейшее изучение неизвестной последовательности)

Этапы цикла ПЦР:
1) первичная денатурация ДНК (около 3 мин, 95С) - только в самом начале, не повторяется в каждом цикле
2) денатурация ДНК (15-20 сек, 95С)
3) отжиг праймеров (15-20 сек, 50-60С)
4) элонгация (около 30 сек, 72С)
5) терминальная элонгация (около 3 мин, 72С)
6) хранение (около 4С)
!!! пункты 2,3,4 повторяются каждый цикл. Обычно для амплификации фрагмента осуществляют 20-30 циклов.



Компоненты ПЦР:
- полимераза: Taq-полимераза - из Thermus aquaticus, быстрая, не исправляет ошибки; проходит 1 тпо за 20 сек. Pfu-полимераза из Pirococcus furiosus, имеет корректирующую (3’-5’-экзонуклеазную активность), поэтому и работает медленнее, но точнее (1 тпо за 1-2 мин)
- буфер (трис-HCl) создает оптимальные условия для работы фермента
MgCl2, ионы магния участвуют в образовании комплекса праймеров с ферментом (увеличивает эффективность реакции)
матрица
- дНТФ (АТГЦ), фермент не должен испытывать недостатка в субстрате
- праймеры, олигонуклеотиды из 20-30 по, прямой и обратный. Подбираются по температуре отжига (она должна быть примерно одинакова для обоих праймеров, чтобы степень их отжига на матрице была одинакова); по оптимальной посадке.
- дополнительно: бычий сывороточный альбумин (БСА), бетаин - для стабилизации ДНК-полимеразы

Еще немного про по праймерам:
- формула Уолесса используют для определения температуры плавления праймеров (определяется длинной и ГЦ-составом)

С праймерами могут возникать некоторые сложности:
они могут образовывать шпильки сами на себя => не будут отжигаться
если между двумя праймерами есть участок комплементарности, то они могут образовать перекрестный димер => не будут отжигаться
если значимо различаются температуры отжига, то ПЦР тоже может плохо пойти.

ОТ-ПЦР:
сочетание обратной транскрипции (фермент обратная транскриптаза/ревертаза), в результате которой из РНК получаем кДНК, и обычной ПЦР (амлифицирем полученную однонитевую кДНК). Эту реакцию обычно осуществляют с помощью двух ферментов — обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы — либо в двух пробирках (в первой при 37 °С по матрице РНК синтезируют кДНК, затем во второй проводят стандартную ПЦР), либо в одной (все реагенты смешивают вместе, дают отстояться 1 час при 37 °С и помещают в циклер).



Используют в изучении экспрессии генов. ОТ-ПЦР незаменима при работе с вирусами, геном которых представлен молекулой РНК, в диагностике некоторых видов рака по специфическим транскриптам опухолевых клеток, а также в генной инженерии, если нужно экспрессировать эукариотический ген в бактериальных клетках.